在生物体中，生物钟与环境昼夜变化的同步非常关键。这是一个精密的生理过程，使生物体能够适应不同的环境条件，如光照和温度。生物钟与我们的生活密切相关，它影响我们的睡眠、饮食习惯以及其他生理功能。生物钟，又称昼夜节律，是生物体内调控生理活动的一种自然规律。果蝇作为研究昼夜节律的重要模型生物，科学家们主要关注它们的三个关键蛋白：Cry（感光蛋白）、Tim和Per（Period）。其中，Tim和Per形成的负反馈回路对于维持24小时周期至关重要。随着Tim和Per蛋白的积累，它们会形成复合物进入细胞核，从而抑制自身和其他生物钟信号蛋白的表达，降低其蛋白水平（图1）。因此，负反馈回路使得生物钟重要信号蛋白水平呈现周期变化。另一方面，感光蛋白Cryptochrome (Cry) 在生物钟与环境昼夜变化的同步中发挥了至关重要的作用。光照激活后的Cry发生结构变化，促进其与Tim结合，引发一系列的蛋白降解过程来调节Tim蛋白水平，从而使生物钟与环境昼夜变化同步。因此，近年来，Cry与Tim之间由光照调控的相互作用成为了生物钟昼夜性研究的热点。揭示其结构信息有助于我们理解其感光性、作用机理，并设计改造生物光控工具。然而，由于Tim蛋白具有较大的分子体积和低稳定性，生物学家们多年来难以通过传统手段获得足量的Tim蛋白，使得Cry-Tim复合物的结构研究进展缓慢。2023年4月26日，来自康奈尔大学的林常帆等人（Brian Crane研究组）最近在Nature上发表了文章Cryptochrome–Timeless structure reveals circadian clock timing mechanisms，解决了多年来昼夜节律研究中的难题。作者通过冷冻电镜技术解析出果蝇中感光蛋白Cryptochrome (Cry) 和昼夜节律调控蛋白Timeless（Tim）之间的相互作用机制，为我们对生物钟的深入理解开辟了新途径。林常帆等人采用昆虫细胞体系来表达稳定性较低的蛋白质，并借助该研究组对Cry的研究基础，使用去除末端的Cry变体（称为Cry∆）来提高Tim蛋白的稳定性。为了进一步提高样品纯度以满足冷冻电镜的要求，作者利用基于纳米抗体改造的ALFA tag提高纯化效率，并使用新型化学交联剂DSSO通过共价键稳定复合物结构。同时，作者使用分子排阻柱去除复合物以外的杂质，包括未形成复合物的Cry/Tim单体。这些创新方法帮助作者获得了高质量、高分辨率的复合物结构（图2）。作者发现，庞大的Tim以一种“拥抱”的姿态，通过一端的灵活区域（氨基酸位点1209-1211）和另一端的ARM repeats（Armadrillo repeats，通常由三个α-螺旋构成，形成一个紧凑的右手超螺旋。这些α-螺旋通过短回路相连，并以串联方式排列，形成一个更大的超螺旋结构）与Cry结合（图3）。Tim的ARM repeats与Cry的结合方式为果蝇适应不同地理纬度和光照变化提供了结构学解释。生物学家发现果蝇中的Tim蛋白有两种不同形式，S-Tim和L-Tim（L-Tim的ARM repeats端有额外的23个氨基酸）。自然界不同地区的果蝇中，两种Tim蛋白的比例存在很大差异。研究表明，ARM repeats在Tim与Cry的结合中起到了关键作用。因此，L-Tim中额外的23个氨基酸所带来的结构变化会导致S-Tim和L-Tim具有不同的Cry结合强度。这种结合强度的变化有助于果蝇精确调控自身的生物钟，以适应不同的环境光照。另一方面，文章通过结构分析为长期关注的Cry C端尾巴的作用提供了明确解释。Tim会与Cry C端尾巴竞争结合位点。在黑暗条件下，C端尾巴起到了遮盖结合位点的作用，因此Cry不会与Tim结合。然而，在光照条件下，Cry结构发生变化，C端尾巴从结合位点脱离，从而为Tim提供结合机会（图4）。图4:Tim与Cry C端尾巴竞争结合位点，解释了为何Cry只会在光照下结合Tim作者们还发现了Tim中重要的结构区域——groove，为Tim进入细胞核的机制提供了结构基础 (图5)。先前的研究发现，Tim的核内进入受到磷酸酶Sgg和Ck2以及氨基酸274到290的调控，但具体的作用机制尚不明确。本文的结构分析为此现象提供了解释。Tim groove中的氨基酸90到92是impα1的重要识别位点，有助于Tim进入细胞核。然而，由于groove peptide的遮挡，impα1不能直接结合。当磷酸酶磷酸化位于groove peptide上的氨基酸274到290之后，groove peptide会打开，从而有利于impα1的结合（图6）。综上，本研究利用冷冻电镜技术成功揭示了果蝇光敏感蛋白Cry与昼夜节律调控蛋白Tim之间的分子结构及相互作用机制。同时，对Tim蛋白在细胞核内转运的调控机制提供了有力的解释。这项研究为我们深入理解昼夜节律调控机制奠定了理论基础，并为开发相关治疗策略提供了潜在的靶点。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-023-06009-4
